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使用FLUOREYE測量貼壁哺乳動物細(xì)胞的融合度

更新時間:2024-12-16瀏覽:74次

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簡介

FLUOREYE是一種熒光檢測解決方案,專為與現(xiàn)有系統(tǒng)無縫集成而設(shè)計,無需額外空間或設(shè)備。它有兩個激發(fā)波長和兩個檢測波長,可實(shí)現(xiàn)集成的熒光信號定量和后續(xù)均一化,無需用戶干預(yù)。在這里,我們展示FLUOREYE可用于測量被SYBR™ Safe(一種高靈敏度的熒光核酸染料)染色的活細(xì)胞熒光強(qiáng)度,從而確定96孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞的融合度。因此,F(xiàn)LUOREYE將其用途擴(kuò)展到細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。在Hamilton自動化液體處理設(shè)備上使用FLUOREYE進(jìn)行自動細(xì)胞融合度測量,可以在96孔板中追蹤培養(yǎng)細(xì)胞的生長,而不需要顯微鏡、精密的成像設(shè)備或復(fù)雜的分析軟件。按照易操作的自動化工作流程,把細(xì)胞用SYBR™ Safe核酸染料(Invitrogen S33102)進(jìn)行染色,然后將培養(yǎng)板放在工作站臺面上進(jìn)行分析。這種方法減少了成本和用戶干預(yù),同時提高了可重復(fù)性和通量。

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優(yōu)點(diǎn)

1. 在細(xì)胞檢測或細(xì)胞培養(yǎng)的自動化解決方案中,它是一種測量細(xì)胞融合度的實(shí)用、經(jīng)濟(jì)高效的工具。

2. 無需動手就可以自動選擇合適的時間點(diǎn)開始細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗、傳代或進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗。

3. 高度可重復(fù)、標(biāo)準(zhǔn)化和準(zhǔn)確的細(xì)胞融合度測定方法。

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使用Hamilton FLUOREYE自動測量細(xì)胞融合度是傳統(tǒng)顯微鏡成像的一種高性價比的替代方法,也是哺乳動物細(xì)胞生長追蹤的一種無人值守、易于整合的臺面式解決方案。


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細(xì)胞培養(yǎng)

在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下,在添加了10%FBS(Gibco,A5256801)的高糖DMEM(Gibco,L0101-500)培養(yǎng)基中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞。實(shí)驗前一天,對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),并將其接種在黑色96孔板(Greiner CELLSTAR 655090)中。SYBR™ Safe染色和FLUOREYE測量在Hamilton Microlab STAR平臺上進(jìn)行。為避免移液過程中細(xì)胞脫落,每一步操作完成后,孔中都要留出最少50µL的液體。用生長培養(yǎng)基將50µL SYBR Safe染料稀釋到500倍,然后每孔加入50µL染色液,最終稀釋到1000倍。

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用戶將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)結(jié)束后,將96孔板重新放到STAR平臺上。清洗細(xì)胞并替換為D-PBS培養(yǎng)基,以減少背景熒光。FLUOREYE測量在470nm波長下進(jìn)行,LED功率為40。為了將測得的強(qiáng)度與細(xì)胞融合度進(jìn)行定量比較,進(jìn)行了手動顯微鏡檢查。


使用ImageJ軟件進(jìn)行成像和融合度分析

用于融合度測量的亮場(BF)圖像由配備5倍物鏡和Axiocam 305成像裝置的蔡司Axiovert 5顯微鏡拍攝。對BF的tiff圖像格式進(jìn)行裁剪以減少孔壁陰影,并使用ImageJ(1.54f 版)進(jìn)行分析。測量像素面積,并以總覆蓋面積的百分比表示融合度。


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技術(shù)

FLUOREYE體積小巧,所需空間極小,可輕松集成到現(xiàn)有設(shè)備中,升級到熒光檢測解決方案,而無需昂貴的整合、外罩、運(yùn)輸設(shè)備或為避免碰撞所進(jìn)行的編程工作。FLUOREYE具有兩個激發(fā)波長和兩個檢測波長,可進(jìn)行集成的熒光定量,隨后無需用戶干預(yù)的均一化使之可與目前市場上的許多試劑盒兼容。


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結(jié)果

用SYBR Safe核酸染料對HEK293細(xì)胞進(jìn)行染色,然后用FLUOREYE在470nm波長下測量熒光強(qiáng)度。每孔強(qiáng)度與BF顯微鏡成像計算出的融合度相關(guān)??傮w而言,實(shí)際細(xì)胞融合與FLUOREYE測量的熒光強(qiáng)度之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性(R2=0.976)。細(xì)胞匯合度和熒光強(qiáng)度之間的線性相關(guān)在10% - 80%之間尤為準(zhǔn)確,而在密度較高時,差異增大,這可能是由于細(xì)胞壓實(shí)和過度生長造成的。此外,F(xiàn)LUOREYE讀數(shù)顯示,細(xì)胞融合度在10 - 80%之間時,復(fù)孔之間的差異非常小(CV <8%)。

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